Mudanças na abundância microbiana e na composição do microbioma intestinal podem ser gatilhos doenças em humanos. O microbioma é uma comunidade ecológica dinâmica que consiste em múltiplos táxons, cada um potencialmente interagindo entre si, com o hospedeiro e com o ambiente.
Os objetivos fundamentais da pesquisa do microbioma humano são estudar a estrutura e a dinâmica das comunidades microbianas, as relações entre seus membros (microrganismos, partículas virais e hospedeiro) e sua associação potencial com a saúde e a doença. O estudo das interações entre os DNAs, RNAs e vírus que estão presentes no microbioma são o principal interesse da metagenômica, metatranscriptômica e virômica, respectivamente.
Para estudar a comunidade microbiana do microbioma humano usando tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, existem vários tipos de análises em larga escala: a análise de perfil 16S que se baseia no sequenciamento das regiões hipervariáveis do gene 16S rRNA e a análise shot-gun que se baseia no sequenciamento direto do DNA total (metagenoma) e/ou RNA total (metatranscriptoma). Além disso, o componente viral do microbioma (viroma) também pode ser analisado pelo sequenciamento das partículas virais totais.
Na última década, muitos estudos usando o sequenciamento do gene 16SrRNA para caracterizar a composição da microbiota foram conduzidos, no entanto, essa análise identifica principalmente a abundância e a diversidade de bactérias e arqueas na amostra.
A análise metagenômica também identifica a abundância e a diversidade da comunidade microbiana, mas adicionalmente pode identificar o conteúdo de genes e o potencial funcional de proteínas codificadas nos genomas da comunidade microbiana.
A análise metatranscriptômica permite a identificação de transcritos expressos no microbioma. Os números de transcritos também podem ser usados para comparar os perfis de expressão gênica entre comunidades microbianas. Para estudo comparativo, dados metatranscriptômicos devem ser pareados com dados metagenômicos para analisar se a abundância de transcritos está refletindo mudanças na composição da comunidade.
O uso de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento para analisar metagenomas humanos também revelou a existência de muitos bacteriófagos (vírus que infectam bactérias) em metagenomas. Foi proposto que os bacteriófagos podem ter um papel na formação da diversidade e composição das bactérias orais e intestinais. Além disso, o envolvimento de fagos na disbiose microbiana pode contribuir indiretamente para a doença.
Método 16S
O método 16S é uma das ferramentas mais utilizadas na microbiologia para caracterizar e comparar comunidades microbianas, como a que habita nosso intestino. Ele se baseia na análise de uma região específica do RNA ribossomal 16S (16S rRNA), uma molécula essencial para a síntese de proteínas em bactérias.
Por que o 16S rRNA é tão importante?
Universalidade: Está presente em quase todas as bactérias, o que o torna um marcador molecular ideal para estudos comparativos.
Variabilidade: Apresenta regiões altamente conservadas, que permitem a identificação em nível de filo ou gênero, e regiões variáveis, que possibilitam a discriminação em nível de espécie.
Como funciona o método 16S?
Coleta da amostra: Uma amostra de fezes é coletada para analisar a microbiota intestinal.
Extração do DNA: O DNA bacteriano presente na amostra é extraído.
Amplificação do gene 16S: A região do gene 16S de interesse é amplificada por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), gerando muitas cópias desse fragmento.
Sequenciamento: Os fragmentos amplificados são sequenciados, gerando milhões de sequências curtas.
Análise bioinformática: As sequências obtidas são comparadas com bancos de dados de referência para identificar os diferentes tipos de bactérias presentes na amostra e estimar suas abundâncias relativas.
O que podemos aprender com o método 16S?
Composição da microbiota: Quais tipos de bactérias (até nível de gênero) estão presentes no intestino e em que proporções.
Diversidade da microbiota: Quantas espécies diferentes de bactérias habitam o intestino.
Alterações na microbiota: Como a composição da microbiota muda em diferentes condições de saúde ou em resposta a intervenções, como a dieta ou o uso de probióticos.
Aplicações do método 16S:
Diagnóstico de doenças: O desequilíbrio da microbiota intestinal (disbiose) está associado a diversas doenças, como doenças inflamatórias intestinais, obesidade, diabetes e doenças neurodegenerativas. O método 16S pode ajudar a identificar biomarcadores microbianos para o diagnóstico dessas doenças.
Avaliação da eficácia de tratamentos: O método 16S pode ser utilizado para monitorar as mudanças na microbiota em resposta a diferentes tratamentos, como o uso de probióticos ou prebióticos.
Pesquisas sobre a microbiota: O método 16S é fundamental para avançar na compreensão da função da microbiota intestinal e sua relação com a saúde humana.
Método Shotgun
Método Shotgun para Avaliação da Microbiota Intestinal: Um Olhar Profundo
O método shotgun é uma ferramenta poderosa e cada vez mais utilizada para analisar a microbiota intestinal. Essa técnica, baseada no sequenciamento de DNA de alto desempenho, permite um olhar abrangente e detalhado sobre a complexa comunidade de microrganismos que habitam nosso intestino.
O que é o Método Shotgun?
Em essência, o método shotgun consiste em fragmentar aleatoriamente o DNA total presente em uma amostra fecal (onde a microbiota intestinal é rica), sequenciar esses fragmentos e, em seguida, reconstruir os genomas dos microrganismos presentes. Essa abordagem permite identificar não apenas quais espécies estão presentes, mas também seus genes e funções.
Por que o Shotgun é Tão Útil?
Análise completa: Ao contrário de outras técnicas que se concentram em marcadores genéticos específicos, o shotgun sequencia todo o DNA presente na amostra, fornecendo uma visão holística da microbiota.
Identificação precisa: Permite identificar não apenas bactérias, mas também fungos, vírus e outros microrganismos presentes no intestino.
Funções microbianas: Ao analisar os genes presentes, é possível inferir as funções metabólicas dos microrganismos, como a produção de vitaminas, a digestão de fibras e a resistência a antibióticos.
Relação com a saúde: Essa técnica tem sido crucial para entender a relação entre a microbiota intestinal e diversas doenças, como obesidade, diabetes, doenças inflamatórias intestinais e distúrbios do neurodesenvolvimento.
Como Funciona na Prática?
Coleta da amostra: Uma amostra fecal é coletada e armazenada adequadamente para preservar o DNA dos microrganismos.
Extração do DNA: O DNA total é extraído da amostra.
Fragmentação e sequenciamento: O DNA é fragmentado em pequenos pedaços e sequenciado utilizando tecnologias de sequenciamento de nova geração.
Análise bioinformática: Os dados de sequenciamento são processados utilizando softwares especializados para identificar os diferentes microrganismos presentes e suas funções.
Interpretação dos resultados: Os resultados são analisados por especialistas para gerar um relatório detalhado sobre a composição e função da microbiota intestinal do indivíduo.
Aplicações do Método Shotgun
Diagnóstico: Identificação de desequilíbrios na microbiota associados a doenças.
Prognóstico: Predição do risco de desenvolver determinadas doenças.
Monitoramento de tratamentos: Avaliação da eficácia de probióticos, prebióticos e outros tratamentos para restaurar a microbiota.
Pesquisa: Desvendamento dos mecanismos moleculares que ligam a microbiota à saúde e à doença.
Os métodos shotgun são mais caros que 16S, mas fornecem mais informações para que o profissional de saúde possa atuar de forma mais precisa.
